Während dieser Jahre 1503-1506 oder nach anderen Quellen 1510-1515, nahm Leonardo auch das Porträt der Mona Lisa, der neapolitanischen Hausfrau Lisa del Giocondo, Gattin des Zanobi del Giocondo, wieder auf (wenn er es denn tatsächlich schon vor seinen Reisen mit Cesare Borgia begonnen hatte) und vollendete es. In dieser Frau hatte er ein Modell gefunden, dessen Gesicht und Lächeln den einzigartigen, rätselhaften Charme besaß, der ihn entzückte. Er arbeitete an ihrem Porträt, wie er sagte, während eines Teils von vier aufeinanderfolgenden Jahren und ließ während der Sitzungen Musik spielen, damit der gespannte Ausdruck nicht aus ihrem Gesichtsausdruck verblasse. Zeit seines Lebens konnte sich Leonardo nicht von diesem Bild trennen und es begleitete ihn auf allen seinen weiteren Lebenstationen. Erst nach seinem Tode wurde das Bild von Franz I. für viertausend Goldflorin gekauft und ist heute eines der Prachtstücke des Louvre Paris. Man sagt dass es bis heute keiner geschafft habe das einzigartige lächeln der Mona Lisa zu kopieren.
Der Reichtum der Farben, über den sich Vasari ausließ, ist in der Tat verflüchtigt, teils wegen Beschädigungen, teils weil der Maler bei seinen Bemühungen um Effekte daran gewöhnt war, seine Figuren auf dunklem Hintergrund zu modellieren, und in diesem wie in seinen anderen Ölbildern ist der Hintergrund in erheblichem Ausmaß durchgekommen. Nichtsdestotrotz schlägt das Porträt den Betrachter selbst in seinem abgedunkelten Zustand unwiderstehlich in den Bann, sowohl durch die Raffinesse des Ausdrucks, durch die Verfeinerung und Präzision der Zeichnung, als auch durch die romantische Erfindung des Hintergrunds. Es ist das Thema endloser kritischer Schwärmereien gewesen.